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重要啤酒成分与气相色谱分析

 发布时间:2011-06-28 点击量:5221

      近年气相色谱法(GC)已成为国内啤酒业的重要仪器分析手段。本文综述了重要啤酒成分及其GC法分析手段,特别对严重影响啤酒质量的重要成分作以介绍,并总结了国内外对其分析测定的GC法。

  国外关于GC用于啤酒研究的zui早报告发表于1956年,20世纪70~80年代,有关GC在啤酒酿造中的应用报告越来越多,分析样品涉及到大麦、酒花、麦芽、辅料、麦汁、发酵液、啤酒、酵母及污染菌等,分析组分包括醇类、酯类、酮类、醛类、含硫化合物、酸类、后酒花风味、酒花油及非挥发性组分等。而国内啤酒行业应用GC法始于80年代,相关院校及研究所分析工作者做了一些工作,主要分析啤酒中双乙酰和低沸点的乙醛、醇酯类等轻组分。90年代各大啤酒集团购置GC仪器,对GC法在啤酒酿造过程中有关啤酒研究和质量控制中的应用研究已开展起来,但其深度和广度远不及国外同行。本文总结了影响啤酒质量的重要组分及其国内外较完善的GC分析法,以求对国内啤酒行业的GC色谱分析工作者有所裨益。

  GC法作为啤酒研究和质量控制的重要分析手段,首先要考虑样品的制备。现有制备方法有四种,包括直接进样、溶剂萃取、蒸馏和顶空进样,优缺点见下表。

  方法优缺点

  1.直接进样简单、快速易受非挥发性分的干扰;

  2.溶剂萃取具选择性,可浓缩样品易造成人为污染,费时;

  3.蒸馏样品分级不*回收,热分解,费时;

  4.静态顶空进样适于微量组分的检测样品取样量大,受水干扰;

  5.动态顶空进样可预浓缩微量挥发性组分要求吸咐剂热稳定性好;

  静态顶空进样可直接检测啤酒中会计师相对高的微量组分,而动态顶空进样时,样品由捕集器中吸附剂所吸附而富集,与毛细管柱配合使用,克服静态顶空进样的局限性,扩大了检测组分,提高分离度。Verzele和Sandra建议对低分子量的挥发物采用静态或动态顶空进样,中等分子量的挥发物用二硫化碳提取,高等分子量的挥发物用连续的液—液提取。顶空进样技术,PEG20M和FFAP分析柱,配置氢火焰离子化检测器(FID)、电子捕获检测器(ECD)、火焰光度检测器(FPD),程序升温,可分析绝大多数影响啤酒质量的重要组分。

  1、醇类

  醇类是啤酒中重要风味物质,主要有乙醇、醇及芳香醇。乙醇作为酵母的主要终产物,啤酒中含量37000~38000ppm,除气啤酒可直接进样,Chromosorb103或GDX—102和103柱,160~190℃恒温运行,FID检测,几分钟即出乙醇峰,此法可用于常规质控分析和快速在线乙醇监测。

  醇主要包括正丙醇、异丁醇、2—甲基丁醇、异戊醇和苯乙醇。啤酒中醇的标准含量为100~150ppm,醇的测定可由聚乙二醇PEG20M和抗氧化型PEG(FFAP)分析柱,顶空进样,程序升温,FID检测。可供选择的分析柱有ParmaphPEGDB—WaxParmapaispvmsSE—54HP—20MCarbowax20MHP—FFAPHP—5Supelcowax—10AC20等。

  对羟基苯乙醇和色醇(吲哚醇)赋予啤酒溶剂味、不愉快的苦味、酚味,为非挥发芳香醇,由乙酸乙酯萃取,添硅酮玻璃柱10%ul—w—98DiatoportS.程序升温155~295℃,FID检测,进行GC定量分析。

  2、酯类

  啤酒中适量的酯类赋予啤酒酯香味,使酒体丰满协调。如过量超过阈值,形成不愉快的香味。啤酒中酯类总量为15~50ppm。酯类常具有这样或那样水果味,增强啤酒风味,其风味指数(浓度与风味阈值比率)越高,啤酒风味组成越有效。一般来讲乙酸异戊酯是酯味重要组成部分,其次为乙酸乙酯、已酸乙酯和乙酸苯乙酯。

  酯类由醇类和脂肪酸的乙酰辅酶A衍生物反应在酵母细胞内形成,各种条件下均可,形成的酯类部分透过细胞壁,分泌到发酵液中,部分吸附在酵母细胞内壁,留于细胞内,癸酸旨以上的酯类几乎全在酵母细胞内,当酵母自溶时,高碳链脂肪酸的酯类会释放出来,作为检测酵母自溶的重要指标。

  酯类测定常使用DB—Carbowax20MHP—FFAPSE—54DB—5等分析柱,与上述醇测定使用柱子相似,实际分析中低沸点的乙醛、醇和酯类往往一同测定,二氯甲烷、乙酸乙酯和二硫化碳萃取样品,直接或顶空进样,程序升温,FID检测,进行GC分析。

  3、酮类

  双乙酰与2.3—戊二酮合称为连二酮,由于2,3—戊二酮在啤酒中含量较低,一般是0.08ppm,对啤酒风味影响较小。而双乙酰风味阈值为0.1ppm,啤酒中其含量超过阈值,具有不愉快的奶酪味、馊饭味。一般啤酒双乙酰控制在<0.1ppm,啤酒<0.05ppm。乳酸杆菌、足球菌等细菌污染亦造成双乙酰升高,而2,3—戊二酮含量很低,如果二者含量都较高,说明是酿造缺陷造成的。酵母发酵过程中,α—乙酰乳酸经厌氧加热或α—乙酰乳酸脱羧酶作用,形成乙偶姻。啤酒中含量低至1—5ppm,15—20ppm均为正常值,风味阈值较高50ppm,对啤酒风味影响较小。

  测定联二酮的方法是:以丙酮、2,3—已二酮或1,2—二氯丙烷作为内标,填充柱10%PEG20M/ChromosorbW(AW—DWS)60—80目或PEG1500/CarbopackC和毛细管柱CarbowaxPorapakQ均可选择,顶空进样,ECD检测,可作为啤酒酿造过程中质量控制分析。

  4、醛类

  啤酒中醛类来自麦汁煮沸中美拉德反应和啤酒发酵过程中醇类还原。大多数不饱和醛类作为啤酒氧化和老化风味,使啤酒产生多种劣味。对啤酒风味和质量有重要影响的醛类主要有乙醛、糠醛和反—2—壬烯醛。

  啤酒中含量zui高的主要醛类是乙醛,丙酮酸脱羧而成,风味阈值10ppm,发酵啤酒中含量3.5~15.5ppm,成熟啤酒中含量应<10ppm,啤酒中含量<6ppm。乙醛影响啤酒口味的成熟,啤酒中含量>10ppm,产生不愉快的粗糙苦味,含量过高,具有辛辣的腐烂青草味。与双乙酰和硫化氢共同构成嫩啤酒的固有生青味。酵母和麦汁污染杂菌(发酵单胞菌)亦可增加啤酒中乙醛含量。由于乙醛低沸点高挥发性,GC直接进样就可测出。顶空进样时,使用PEG或FFAP分析柱,FID检测,与啤酒中醇和酯类一同测定。

  国外研究表明,糠醛的增加与羰基化合物(主要是醛类)的增加是平行的,因此糠醛水平的变化可指示影响风味的羰基化合物的变化,如糠醛含量>100ppb,可作为原始风味败坏的指示信号。Davis和Palamand报告其GC定量测定,由于其高沸点低挥发性,利用HPLC方法测定。

  反—2—壬烯醛的形成是啤酒老化的主要原因之一,产生的主要机制是脂类和游离脂肪酸的酶促和非酶促氧化,糖化时发生的不饱和脂肪酸的氧化是zui重要的反应,zui终导致反—2—壬烯醛的形成,风味阈值0.1ppb。测定麦汁过滤后样品中反—2—壬烯醛方法,麦汁在pH2的条件下回流,用二硫化碳萃取,PEG20M或FFAP柱上分离。B.W.Drose等将样品经Sep—pakC18浓缩,氮气吹干,正戊烷洗脱,65℃下florox衍生1小时,CP—Sil19CB分析柱,程序升温180—300℃,ECD检测,或啤酒的正戊烷提取液,DBWAX分析反—2—壬烯醛及其前体物,为研究啤酒稳定性提供分析手段。

  5、酸类

  啤酒中的酸类虽不构成啤酒的香味,但是主要呈味物质,啤酒中的酸类及其盐类控制啤酒的pH值和总酸含量,适宜的pH值和总酸能赋予啤酒柔和清爽的口感,同时作为重要缓冲物质,控制啤酒的pH值,利于各种酶的作用。缺乏酸类,啤酒口感呆滞、粘稠、不爽口;过量的酸类使啤酒口感粗糙、不柔和、不协调,对啤酒香味、起泡特性及酯类形成影响较大。此外酵母和污染菌的脂肪酸分析可作为菌种鉴定指标,啤酒中有机酸种类和含量是判断啤酒发酵是否正常进行和是否污染产酸菌的标志。

  啤酒中的酸类约100种,分为不挥发酸、低挥发酸和挥发酸。不挥发酸主要有乳酸、琥珀酸、焦谷氨酸、柠檬酸、延胡索酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、乙醇酸、异柠檬酸、α-酮式戊二酸等;低挥发酸主要有丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、已酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸等脂肪酸;挥发酸主要有甲酸和乙酸。啤酒中主要脂肪为C6-C10。长链不饱和脂肪酸主要来自麦汁C16-C18和酵母糖代谢,麦汁中主要脂肪酸是C16-C18,其中C16:1、C18:2、C18:3为重要不饱和脂肪酸,来源于相应的饱和脂肪酸,糖化时在氧的作用下不饱和脂肪酸自氧化和酶促氧化,产生啤酒老化风味物质——不饱和醛类。酵母自溶导致中链脂肪酸如丁酸、异戊酸、已酸、辛酸和癸酸含量增加,对啤酒风味影响极大。GC法分析酵母自溶物中脂肪也是十分有意义的。

  David等人将非挥发性酸类甲基化后经氯仿提取,挥发性酸类经乙醚提取,采用玻璃填充柱10%SP10或1%磷酸,100/200目ChromosorbW–AW,115℃恒温,顶空进样,FID检测,定量分析丙酮酸、乳酸、草酸和琥珀酸非挥发性酸类及C2-C7低挥发性酸类。Powell和Vinth等采用二硫化碳萃取直接进样,FFAP或PEG分析柱,经质谱仪鉴定,分离和测定C2-C12脂肪酸。Susan等将样品经乙酸乙酯萃取,DB-WAX分析柱,L.E.Stenroos等将样品经二氯甲烷萃取,Carbowax20M分析柱,程序升温,顶空进样,FID检测,与部分醇、酯、酮类一起测定C2-C10脂肪酸。Karen,Macpherson,Chen和Taylor等用氯仿-甲醇溶液萃取,三氟化硼-甲醇进行甲酯化反应,聚乙二醇或DB-225,10%SPChromasorb柱分离,程序升温,顶空进样,FID检测,测定啤酒、麦汁和酵母中C8-C18游离脂肪酸。

  6、含硫化合物

  啤酒中的含硫化合物分为挥发性和非挥发性,前者占啤酒中含硫化合物的1%,后者则包括无机硫化硫和含硫氨基酸,作为挥发性含硫化合物的前体物质,它们主要来自麦芽、辅料、酒花、酿造水及酵母的硫代谢。啤酒中很多挥发性含硫化合物是强风味低阈值物质,虽然浓度较低,但对啤酒风味的影响很大,特别是一些低分子量的含硫化合物对风味的影响更大,而且这些作用常常对啤酒质量是有害的。对啤酒质量有重要影响的含硫风味物质主要是二甲基硫(DMS)、SO2、H2S和3-甲基-2丁烯-1-硫醇。

  DMS为陈贮啤酒风味的特色组分,标准含量为20~70ppb,过量则有令人不快的腐烂蔬菜/卷心菜味道。麦汁污染细菌直接产生DMS,DMSzui高可达200ppb以上。杀菌和啤酒储存中,啤酒中DMS含量有微量增加。SO2可与羰基结合形成中性风味组分,延迟啤酒风味的老化和走味,为了改善啤酒的口味稳定性,生产中常常在麦汁制造和滤酒时添加亚硫酸氢钠、亚硫酸、液态SO2等,添加量不超过20mg/l,在8~10mg/l。SO2含量小于10mg/l,不会引起不愉快的气味,过量则会产生硫的口味。啤酒中绝大部分H2S由酵母代谢产生,H2S在啤酒中气味阈值为5~10ug/l。当啤酒中H2S>10ug/l时,啤酒有生酒味;当>50ug/l时,有臭鸡蛋味,而啤酒中只有1—5ug/l。啤酒中DMS、SO2、H2S可由CarbopakBHT100柱分离,DMS还可由15%PEG1500ChromasorbW80–100目或FaruphPEG柱分离,顶空进样,FPD检测,定量GC分析。

  啤酒曝露于350–500nm光下会产生光解物质3-甲基-2-丁烯-1硫醇(MBT),此物质有硫臭味,风味阈值低于0.1ppb,是由酒花苦味成分异α-酸经光敏感型的核黄素的光解作用产生的。曝露于日光和人工灯光下的啤酒中已检测出MBT。光照后啤酒样品顶空吸附于Chromasorb101柱,解吸附后直接进入填充12%DC-200ChromasorbW氟代乙丙烯聚合物FEP,定量GC分析。

  7、酒花油及后酒花风味

  酒花油是啤酒重要的香味来源,来源于酒花及其制品的添加,主要成分为单萜烯和半萜烯、石竹烯、香味烯、律草烯、法呢烯,为碳—氢结构化合物,香气极不愉快,是生酒花香的来源;碳—氢—氧原子的醇、酮和酯类,如香叶醇和沉香醇具有玫瑰花香、杏木香气,是啤酒中幽雅香气的主要成分。酒花品种间酒花油含量和种类是有差异的,以此可作为酒花品种的鉴定。真空蒸馏酒花及其制品的酒花油,要用DB—WAX柱,柱头进样,或Parmaphiscms/1701柱,顶空进样,程序升温,FID检测。陈家华等通过循环吸咐法采集酒花香气成分,乙醚洗脱,OV101毛细管柱,程序升温,GC/MS定性,共鉴定113种啤酒花香气成分。

  麦汁煮沸中,单萜烯和半萜烯的碳水化合物一部分随蒸汽挥发掉,一部分未变化的萜可产生强烈气味,口味阈值约5ppb、即可感官测出。麦汁中测出的氧化产物如香叶醇、里哪醇、十一醇、α-萜醇及环氧化合物环氧律草烯,将作为微量成分进入啤酒中,zui终啤酒中含有未改变和已转化好的复杂混合香味组分,称为后酒花风味。正常啤酒中只要含3ppm酒花油,就可感觉到酒花香气。Shuso等采用Sep-pakC18柱吸附样品,二氯甲烷洗脱后浓缩,HP-20M分析柱,FID检测,定量分析啤酒中里哪醇和环氧律草烯。

  8.非挥发组分

  (1)糖类

  麦汁糖化时,淀粉经酶促反应主要产生可发酵性糖类,包括单糖(果糖和葡萄糖)、双糖(蔗糖和麦芽糖)和三糖(麦芽三糖)。经酵母发酵代谢,麦汁中绝大部分可发酵性糖类转化为各级代谢终产物,形成啤酒中各种风味物质。麦汁中可发酵性糖类的合理组成,对研究酵母的降糖性能和形成啤酒特定风味有重要影响。发酵后啤酒中残留的糖类主要有麦芽糖、麦芽三糖、非发酵性糖以及甘油,它们组成啤酒中的甜味物质和营养物质。

  ASBC建议采用Brobst和LOtt的方法,样品加到吡啶中,在催化剂三氟乙酸的催化下与六甲基二硅胺反应,产生的糖类异构体,给定性和定量工作增加困难。Jamieson吸取了Brobst的可取之处,采用OV一17SE一30SE一52分析柱,程序升温,FID检测,定量分析可发酵糖,但啤酒样品必须干燥。

  (2)氨基酸

  麦汁糖化时,蛋自质经酶促反应主要产生18种游离氨基酸,经酵母发酵代谢,麦汁中绝大部分游离氨基酸转化为各级代谢终产物,形成啤酒中各种风味物质。麦汁中氨基酸的合理组成,对形成双乙酰、含硫化合物、醇和酯类等风味物质有重要影响,发酵后啤酒中残留的氨基酸可作为啤酒中的营养物质。

  测定游离氨基酸将样品经离子交换柱去除不相关分子,衍生为具挥发性的三氟代乙基丁酯,串连OV一17/210或ChromasorbW柱,定量分析组氨酸、色氨酸、精氨酸和半胱氨酸,其它氨基酸制成七氟丁酰异戊酯衍生物在SE一30柱上分离。

  (3)酚类

  啤酒中酚类分单体酚和多聚酚,主要来自麦芽和酒花,啤酒中含量25~60ppm和70~100ppm。多酚是啤酒口味助剂,赋予啤酒醇厚性,增强苦味。低分子多酚比高分子多酚沉淀蛋白质的能力要强,高分子多酚的活性较差并保留在麦汁中,使啤酒色泽加深和口味粗糙,低分子多酚具有还原性。使啤酒口感新鲜,对啤酒口味稳定性有促进作用。多酚被氧化,加深啤酒色度,破坏啤酒胶体稳定性,使啤酒苦味变粗糙并产生不愉快的后苦,是啤酒涩味、陈旧味的主要原因之一。酚类与蛋白质形成的复食物,会造成啤酒混浊。包装后的啤酒在室温和突然低温下储存一定时间,啤酒中的单体酚和多聚酚会与蛋白质结合,产生混浊,混浊产生速率可作为包装啤酒的货架寿命指标。

  挥发性酚类可采用蒸汽蒸馏,氧化铝柱或溶剂萃取浓缩后进样,气一液色谱分离测定。非挥发性酚类多采用离子交换树脂尼龙一66和PVPP等固体吸附剂,甲醇、乙酸乙酯等溶剂革取,在吡啶中与六甲基二硅氯烷(HMDS)及*基氯硅烷或HMDS一二甲基甲酰胺,制成*基硅醚(TMS)衍生物,可选择sE一30OV一1Dexsil300GCSE一52分析柱,GC一MS联用鉴定啤酒中70多种酚类。

  酿造水、大麦等原料中的余氯会与麦芽中的多酚形成氯酚臭味,细菌和化学物质污染亦会造成氯,酚臭味,样品富集后,乙酰化反应使弱电负性的酚类化合物转化为具有强电负性的酚乙酰化衍生物,选用OV101SE-300V-10V-17ChromosorbWAWDMCS分析柱,ECD检测。

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