乳、乳制品及饲料中三聚氰胺的测定
一．名词简介
1. 三聚氰胺理化性质
三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m³；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性。
化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
2. 乳制品
是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种食品。本标准所指的乳制品包括液体乳类（杀菌乳、灭菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉类（全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉和调味乳粉、婴幼儿乳粉、其他配方乳粉）、含乳饮料类、炼乳类（全脂无糖炼乳、全脂加糖炼乳、调味炼乳；配方炼乳）、乳脂肪类（稀奶油、奶油、无水奶油）、干酪类（原干酪；再制干酪）、乳冰淇淋类（乳冰淇淋、乳冰）和其他乳制品类（干酪素、乳糖、乳清粉、浓缩乳清蛋白）等。
1. 原理
试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。
2 试剂
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶液。
2.1 磺基水杨酸。
2.2 柠檬酸。
2.3 辛烷磺酸钠：液相色谱离子对试剂。
2.4 乙腈：色谱纯。
2.5 盐酸。
2.6 60 g/L磺基水杨酸：称取60 g磺基水杨酸用水定容至1 L。
2.7 0.1 mol/L盐酸：量取8.3 mL盐酸用水稀释至1 L。
2.8 缓冲液：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L。
2.9 三聚氰胺标准品：已知含量大于99%。
2.10 标准储备液：称取三聚氰胺标准品0.01g（准确至0.0 001g），用甲醇配制成浓度为1mg/mL标准储备液。
2.11 标准系列：将标准储备液用0.1 mol/L盐酸逐级稀释至0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL的系列标准溶液。
3 仪器成套性
3.1 液相色谱仪
3.1.1 P3000型 高压输液泵
3.1.2 UV3000紫外检测器
3.1.3 Rehodyne手动进样阀(20μl)
3.1.4 CXTH3000色谱工作软件
3.1.5 ODS（VenusilASB-C18色谱柱） 250 mm×4.6 mm，5 µm
3.1.6 分析启动工具包
3.1.7 溶剂托盘
3.1.8 试剂包
3.1.9 保护柱和柱芯
3.1.10真空固相萃取装置（含混合型的阳离子交换柱10根）
3.2 溶剂过滤器（含真空泵）
3.3 超声波清洗器
3.4 柱温箱
3.5 高速离心机：转速>4 000 r/min
3.6 旋涡混匀器
3.7 分析天平：感量0.1mg
4 样品处理
4.1 固态乳制品
称取1.0 g左右试样（准确至0.0 001 g），加入0.1 mol/L 盐酸约15 mL，涡旋混匀，超声提取30 min后加入60 g/L磺基水杨酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
4.2 液态乳制品（包含酸奶）
称取15 g左右试样（准确至0.0 001 g），加入60 g/L磺基水杨酸3 mL~4 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
4.3 饲料
称取1.0g左右试样（准确至0.0 001 g），将样品用研钵充分碾碎混匀，加入0.1 mol/L 盐酸约15 mL，涡旋混匀，超声提取30 min后加入60 g/L磺基水杨酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 盐酸定容至25 mL，混匀后离心，上清液经0.45 µm的微孔滤膜过滤后进样。
5 测定步骤
5.1 色谱条件
5.1.1 色谱柱：ODS或C8，250 mm×4.6 mm，5 µm。
5.1.2 流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15。
5.1.3 流速：1.0 mL/min。
5.1.4 柱温：40 ℃。
5.1.5 波长：240 nm。
上述色谱条件是典型的，可根据实际情况做具体调整。如果分离效果不理想，将水相改为：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为10 mmol/L，加3mL三氯乙酸，配制成1000mL溶液，流动相用氨水调PH值3.9到3.95。
5.2 测定
5.2.1 标准曲线制备
将标准系列0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL分别进样20 µL,以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，制作标准曲线。
5.2.2 样品测定
取制备好的试样溶液进样20 µL,进行液相色谱分析。根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺的标准样品色谱图见图1，液态奶样品色谱图见图2，奶粉样品色谱图见图3。
图1 标样色谱图
仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
图2 液态奶样品色谱图
仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
图3 奶粉样品色谱图
仪器：山东金普分析仪器有限公司LC3000
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
6 结果计算
6.1 计算
试样中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）计算:
C×V
X = ————………………………………………………（1）
m
式中：X—样品中三聚氰胺含量，mg/kg；
C—从标准曲线上查出的含量，µg/mL；
V—定容体积，mL；
m—称样量，g。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
本文参考以下方法：
HPLC-UV检测方法
三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用北京创新通恒科技有限公司的ODS，Ｃ１８色谱柱，能够得到良好的结果。
1、 三聚氰胺的FDA检测方法
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0。
流动相：缓冲液：乙腈=85：15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10μL，
进样前用0.22μm针式过滤器过滤
流 速：1.0mL/min
柱 温：40 ℃
波 长：240nm
2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法
色谱柱：山东金普分析仪器有限公司ODS 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠
流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL
进样前用0.22μm针式过滤器过滤
流 速：1.0mL/min
柱 温：40℃
波 长：240nm
山东金普分析仪器有限公司 技术部
